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聚合酶链式反应

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PCR所配的热循环设备

聚合酶连锁反应（英语：Polymerase chain reaction，缩写：PCR）又称多聚酶链式反应，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。透过这项技术，可在短时间内大量扩增目的基因（标的基因）[1][2]，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。DNA 体外扩增的实现首先基于DNA半保留复制原理，还有碱基互补配对原则，即复制的过程中双链DNA会解链，由双链变成单链，温度一般为95℃；之后温度降下来，引物会结合到DNA单链上，在DNA聚合酶的作用下，把游离的dNTP按照碱基互补配对原则结合到单链上，形成一条由旧链和新链杂合成的新的双链DNA。这个过程可概括为变性、黏合、延伸三个基本步骤。

PCR是一种简单，廉价和可靠的复制DNA片段的方法， 可能也是分子生物学中使用最广泛的技术。这个概念适用于现代生物学和相关科学的许多领域[3]，如生物医学研究，犯罪取证和分子考古学[4]等。

微生物复制是一个费时耗力的流程。首先要将DNA经限制酶剪裁，再利用连接酶（Ligase）加到运载体（Vector）中，之后利用受控电脉冲瞬间电击，在质膜上形成可逆性微孔的“电穿孔”（electroporation）或是利用生理极限高温刺激的“热休克”（heat shock）的方式，送到大肠杆菌感受态细胞（competent cell）中，将此菌于培养皿大量繁殖培养，再经过繁复的分离、纯化过程，时间通常需要近一周，才能大量复制片段[5]。所以仅需一小时的PCR能节省大量时间和繁复的操作，聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制，以及亲子鉴定。

历史

  • 最早的PCR机器Baby Blue 1986Thermocycler
    最早的PCR机器Baby Blue 1986Thermocycler
  • 能协同操作的两组式机器
    能协同操作的两组式机器
  • 8块加热板的循环机型
    8块加热板的循环机型

凯利·穆利斯（Kary Mullis）[6][7]，时为Cetus公司的雇员，于1983年开发了此技术。这项技术使他成为1993年诺贝尔化学奖的获得者。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。

DNA聚合酶天然存在于生物体内，在细胞分裂前进行DNA的复制。当DNA开始复制时，解旋酶将双股的DNA分开成两个单股。DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上，生成互补链。在穆利斯最初的聚合酶链式反应中，将DNA聚合酶用于体外试验。但是，没有采用正常细胞常温解旋的方法，而是把双链DNA加热到96℃，使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下，DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始聚合酶链式反应效率极低，需要大量时间和DNA聚合酶，并且在整个聚合酶链式反应中都需要人来照看。

后来，由嗜热细菌水生栖热菌（Thermus aquaticus）体内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的聚合酶链式反应。由于嗜热细菌生活在温度达到50至80 °C（122至176 °F）的间歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于聚合酶链式反应时，高温并不能破坏这种DNA聚合酶，因此不需要不断加入新的聚合酶，聚合酶链式反应由此变得简单并且可以由机器操作。

热循环机

最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生栖热菌（Thermus aquaticus），是1976年台湾科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园发现的，因此被称为Taq。Taq酶被广泛用于当前的聚合酶链式反应操作中，Taq酶的缺点是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在复制DNA时有时会出错，造成DNA序列突变（错误）。但是又是从古菌中获得的Pwo酶及Pfu酶，发现均有校正机制，能够大大降低聚合酶链式反应中的突变。将Taq与Pfu结合使用可以保证真实准确的能够扩增DNA。不但如此，现在一些厂商利用蛋白质的模拟分析，将DNA聚合酶的结构进行人工修改，还可以合成出性能远超原本自然提取而来的酶。

专利之争

聚合酶链式反应技术的专利由Cetus公司持有，穆利斯发明聚合酶链式反应技术的时候在那个公司工作。Taq聚合酶也受专利保护。关于这个技术有几个诉讼案，包括著名的杜邦诉讼案。制药公司Hoffmann-La Roche于1992年买下了专利并持有至今。

在世界各地的多个司法管辖区，罗氏与Promega公司与Taq聚合酶相关的专利争斗仍然在继续。法律上的争论已经超出了聚合酶链式反应和Taq聚合酶专利的期限，这些专利已于2005年3月28日到期。

操作过程

聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片段，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR只能复制很短的DNA片段，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片段，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成：

  • DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片段。
  • 2种引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节）
  • DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。
  • 脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。
  • 含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。

引物

特定的专一性引物决定了所扩增的DNA片段。而引物（primer）本质上是人工合成的短DNA片段，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片段的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。

选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度的引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔点从60℃到75℃。

有时也用到简并引物，是一些相似但不相同的引物的混合物。通常用于从不同的生物DNA中扩增相同的基因，因为这些基因通常都是近似但不相同的。应用兼并引物的另一种情况是根据蛋白质序列设计引物时，由于几个不同的密码子都能编码一个氨基酸，通常难以判断在DNA中究竟是哪个密码子编码的这个氨基酸。例如编码异亮氨酸的引物可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶（关于碱基如何编码蛋白质，可查看遗传密码）。使用简并引物在很大程度上降低了聚合酶链式反应扩增等特异性，这个问题可以使用递减PCR（touchdown PCR）部分地解决。

基于上述考虑，设计引物可以采取以下原则：

  • GC所占比例为40％－60％
  • 计算两个引物的Tm（Tm值=4(G+C) +2(A+T)），使之不相差5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。
  • 黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的聚合酶链式反应选择不同的黏合温度。
  • 内部的具有自身互补性的发夹结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。
  • 3'末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。

现有一些帮助设计引物的程序（见外部链接）。

步骤

一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

  1. 变性：利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
  2. 黏合，又称复性、退火、降温贴合、缓冷配对、引子黏合：在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引子熔点5℃。错误的黏合温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。
  3. 延长：DNA聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。
聚合酶链锁反应简图 (1) 96℃高温下使双股DNA打开 (2)在约68℃下让引子与DNA配对 (3)在72℃ DNA延伸 (P=聚合酶). (4)第一循环完成，做出的两段双股DNA又可当作下一个循环模板，这样每次循环都使得扩增的DNA片段加倍。

实例

优化聚合酶链式反应

在实践中，聚合酶链式反应可以因各种原因而失败，原因可能是由于其对于污染的敏感性，导致扩增出错误的DNA产物。因此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应的反应条件，通过将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。这通常包括从用于分析的区域分离出聚合酶链式反应的设定区域（聚合酶链式反应产物的纯化）、一次性塑料制品的使用以及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。替代缓冲成分和聚合酶的使用有助于较长或存在其他问题的DNA区域的扩增。在缓冲体系中加入试剂，如甲酰胺，或会增加聚合酶链式反应的特异性和产量。此外，可以利用计算机模拟理论聚合酶链式反应结果（电子聚合酶链式反应），以协助引物的设计。

最新进展

PCR及其延伸技术

  • 递减PCR（touchdown PCR）：前几循环温度逐渐下降。
  • 逆转录PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录而来的cDNA为模板，也因为是从表现型基因来进行增量的，由此产生出来的cDNA产物不带有内含子（基因中不具意义的段落），常应用于分子克隆技术。
  • 热启动PCR（hot start PCR）：以高热活化型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。
  • 即时PCR（real-time PCR）：PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测，又称定量PCR（quantitative PCR），可以进行多组对比。
  • 巢式PCR（nested PCR）：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。
  • 多重PCR（multiplex PCR）：在同一个管中使用多组引物。
  • 复原条件PCR（reconditioning PCR）：PCR产物稀释10倍后重新放入原浓度的引物和dNTP等循环3次，以消除产物中的异二聚体。
  • dsRNA合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7 RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase；从双股DNA转录为对应的双股RNA（dsRNA）。可应用于RNAi实验操作。
  • 低温变性共扩增PCR（英语：COLD-PCR）（COLD-PCR, co-amplification at lower denaturation temperature-PCR）:用以检测突变或特殊等位基因的PCR应用技术。
  • 数字PCR（Digital-PCR, digital polymerase chain reaction）：将标准的PCR反应分割至每一个反应中仅1~2个copy。藉以侦测微小比例的基因差异。应用于：癌症突变基因、病原体检测、借由母血对胎儿做产前检测。

一般 PCR 的原理是，靠著探针侦测设定的遗传目标序列，接著经历升温、降温的循环，将目标不断复制放大，直到能够判断讯号。判断阳性的标准，英文称作“cycle threshold （CT） value”，即是 CT值。例如，若循环 35 次后能识别目标存在，CT值便是 35。

通常样本内的病毒含量愈高，复制愈少次，便足以判断阳性。举例来说，原始量多只需 20 次，便能放大到超过足够的量；原始量低需要到 35 次，才能放大到有存在感。（或是可以想像成自己的存款，要翻倍几次才会超过 1 亿元；存款愈多的话，需要翻倍愈少次。）[8]

应用

鉴定基因

人体内的细胞共有约为30亿个碱基对的DNA，每个人的DNA会有差异，具有差异的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异，由此可以识别不同的人。所谓“DNA指纹”，就是把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的人。由于DNA是遗传物质，因此通过对DNA鉴定还可以判断两个人之间的亲缘关系。

亲子鉴定

主条目：亲子鉴定

诊断遗传病

聚合酶链式反应允许白血病、淋巴瘤等恶性疾病的早早期诊断。此法是当今癌症研究中最发达的，并已被常规使用。聚合酶链式反应分析能以高于其他细胞10,000倍的敏感度在核酸DNA样本中直接探测具特定转录的恶性细胞。

聚合酶链式反应同样可以对不可培养的或生长缓慢的微生物（如分支杆菌、厌氧细菌、组培分析和动物模型中的病毒）进行定位。在微生物学中，聚合酶链式反应诊断性应用的基础是传染媒介的探测和从病原种系中借助特定基因的分离出非致病的种系。

复制特定基因

基因工程中目的基因常用PCR技术扩增，再导入载体内，以增加导入成功的概率。

诱变

分析远古DNA

鉴定特定表型的突变体基因

比较基因表达量

基因图谱建立

侦测遗传疾病

基因突变研究

DNA遗传演化

基因表现比较

参考资料

  1. ^ 存档副本. [2022-03-26]. （原始内容存档于2022-05-02）. 
  2. ^ 存档副本. [2022-03-26]. （原始内容存档于2022-05-17）. 
  3. ^ PCR. Genetic Science Learning Center, University of Utah. [2018-01-09]. （原始内容存档于2020-03-02）. 
  4. ^ Saiki, RK. Amplification of a Short DNA Stretch by Repeated Cycles of In Vitro DNA Polymerization (PDF). American Association for the Advancement of Science. [2018-01-09]. （原始内容存档 (PDF)于2017-12-15）. 
  5. ^ 技術文章——聚合脢連鎖反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）. [2016-11-25]. （原始内容存档于2016-11-16）. 
  6. ^ Bartlett, John M. S.; Stirling, David. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. PCR Protocols 226. New Jersey: Humana Press. 2003-08-01: 3–6. ISBN 978-1-59259-384-2. doi:10.1385/1-59259-384-4:3 （英语）. 
  7. ^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" 美国专利第4,683,195号
  8. ^ CT值. PanSci 泛科学. [2021-10-20]. （原始内容存档于2021-04-22） （中文（台湾））. 

外部链接

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