線性二色性
線性二色性(英語:Linear dichroism,簡稱LD)是主要用於研究分子功能和結構的光譜技術。LD可以通過平行或垂直於一個取向方向軸的光吸收的差異測得[1]。LD的測量基於光和物質之間的相互作用,是電磁光譜的一種形式,如今主要應用在研究生物高分子(如DNA)及人工合成的聚合物方面。
基本原理
線性偏振
LD是使用線性偏振光,即被偏振(極化)僅在一個方向上波動的光。光產生的波由僅在一個面內振動的電場向量,使光以典型的正弦曲線形式傳播通過空間。通過使用平行和垂直於分子取向方向的偏振光,可以測量某一個一維的分子相對於其他分子多吸收了多少能量,為實驗主義者提供了信息。
已知光和分子的相互作用,當分子開始吸收光,由於電子被光子激發,能級升高,進入分子的光強將發生變化。這個電子變化稱為電子躍遷,其方向稱為電子躍遷極化。LD測量正是依據這個性質。
一個取向分子的LD值可以被下列等式計算: LD = A║- A┴ , A║是平行於取向軸的光吸收,A┴ 是垂直於取向軸的光吸收。
注意:任何波長的光可被用於產生LD信號。
LD信號因此有兩個極限。對於一個電子躍遷方向平行於取向軸的化學系統,可寫作下式:
LD = A║- A┴ = A║ > 0
對大部分化學系統這代表電躍遷極化順着分子的長度(即,平行於取向軸)。
或者,電子躍遷極化可被視為完全垂直於分子的取向,給出下式:
LD = A║- A┴ = - A┴ < 0
這個等式代表記錄到的LD信號是電躍遷極化順着分子的寬度(即,垂直於取向軸),是兩個軸中較小的一個。
因而,LD可用在兩個方面。如果已知分子在流動中的取向,實驗者可觀測分子極化(偏振化)的方向,進而考慮分子的化學結構;或者如果極化方向是已知的,則可用來測定分子在流動中的取向。
對大分子而言,一些定性的信息如發色基在空間中如何取向可以通過LD信號簡單的獲得。而分子取向多數情況下遵循這樣一個定量的描述:
這裡LDr是 所謂的簡化LD。S是一個比例常數(取向因子),對完美取向來說S=1,對隨機取向來說S=0,決定了宏觀取向的效率。α是特定波長吸 收光產生 的躍遷矩和參考系坐標軸的夾角(如果有在同一波長有多個躍遷吸收那麼取平均值)。A是在各項同性溶液中的吸收度,即無定向條件下。注意:A、A║、A┴和 LD一樣有相同的濃度c和厚度l。因此我們不需要知道樣品的濃度和厚度。
此方程表明在任何取向系統,躍遷矩和參考坐標軸有夾角α,則在以軸為中心形成圓錐上的可能性相等。例如發色團沿着一個螺旋結構存在。
若樣品滿足宏觀上單軸的條件,如在聚合物薄膜上向一個方向拉伸或者存在於電場中的極性分子,A║、A┴和A有一個簡單的關係,使得不需要同時測定這三個量。
A=1/3(A║+ 2A┴)
紫外線二色光譜
UV LD
有一部分生物分子,特別是大型的,易彎曲的,長的分子,通過如NMR和X光衍射法較難判定結構。UV LD(200-400nm)是應用於分析此類分子的代表性方法。尤其是測定DNA構型和藥物-DNA系統的幾何鍵合情況。
測定DNA的基本理論
DNA非常適合於UV LD測定,分子很長且薄,使得它很容易在流動中取向,產生強烈的LD信號。用UV LD測定的DNA系統包括DNA-酶複合物和DNA-配體複合物[2],後者的構成易通過動力學實驗觀察。
核酸吸收和LD譜容易在UV區(最小到180-190nm)處測得,這是被嘌呤和嘧啶的π→π*所控制,此躍遷均於鹼基平面內極化。
DNA配體鍵合
一 旦明白了DNA自身取向,下一步就是運用LD來探測DNA和小配體分子的鍵合和取向情況。一個關鍵的LD研究特性是如果沒有明確的鍵合,就沒有配體躍遷的 LD。相反,假象的配體LD信號從吸收帶中的消失證實了配體的鍵合。儘管LD不能告訴我們配體在何處和DNA鍵合,但它可用來測定配體的取向(如果配體躍 遷矩已知)。這經常給鍵合模式提供有意義的線索。配體和DNA的鍵合可以以多種形式,包括對序列和取向的考慮。一般而言以以下幾種形式:
- 外部:鍵合在磷酸骨架上:這種模式的取向是不確定的而且引起的LD(和CD)信號很小。
- 夾層:鍵合在DNA鹼基之間:這種模式需要平面狀分子,DNA鏈解開,在臨近的鹼基對之間打開一個口子,配體像三明治一樣的夾在其中。
- 在小槽中:這種模式被芳香型分子經常採用,包括有一定旋轉自由度的核內鍵合。例如,長分子如紡錘菌素,偏段黴素,煙酸已可鹼33258和DAPI(4',6二脒基-2-苯吲哚鹽酸),可以順着槽的曲率緊密結合在小槽內,太大而不能夾層的分子更喜歡這種鍵合模式。這些分子的長軸和DNA螺旋軸夾角α=45°,短軸與螺旋軸垂直(平行於鹼基對)。
- 在大槽中:這種鍵合模式在多種調整蛋白中被發現,大槽有足夠的空間使小配體分子在其中有多種取向。
LD較多應用在上述的第2,3種情況中。實際實驗中,通常使用ct-DNA,A-T鹼基聚合物,G-C鹼基聚合物。分別測定ct-DNA的LDr,ct-DNA和配體混合後的的LDr,(A-T)n和配體混合後的LDr值,及(G-C)n和配體混合後的LDr值。通過純DNA的LDr,代入公式求出S(其中α=90°,即鹼基對與螺旋軸的夾角),再分別由三種混合物的LDr值,代入S,求得α,通過夾角判定鍵合模式。
多肽
典型的多肽吸收光譜在180-240nm區域內顯示由三種電子躍遷決定的特徵:酰胺殘基在200nm周圍的兩個從π到π*的強烈激發躍遷矩,和一個220nm周圍從n到π*的弱激發躍遷矩。對α螺旋的多肽來說,一個組分(210nm)順着螺旋軸方向,另一個(190nm)垂直於螺旋軸。如果n→π*躍遷是由於一個只包含碳的發色基,它的偶極矩變化為0。對多肽來說,酰胺發色基的不對稱性導致了π軌道的偶合,躍遷需要一些電特性和每個殘基上的電子躍遷偶極矩。
可以通過拉伸在二氧化硅面上的潮濕薄膜定向聚L-穀氨酸並測定A║和A┴。A║指偏振光平行於薄膜拉展方向,這個方向可能和細絲狀的α螺旋多肽分子更傾向的取向方向相同(螺旋軸)。
校準方法
即將分子排布方向保持一致的方法
庫埃特流
庫埃特流取向系統是應用最廣泛的UV LD樣品取向方法,是現在僅有的確立溶液相中平均分子取向的方法。此方法只需要極少量的樣品(20-40微升)用於分析LD光譜。系統的另一個優點是對樣品的循環使用,允許對每個樣品的重複測定,減少了最終錄得譜的背景噪聲影響。
它的操作模式非常簡單,將樣品放在一個旋轉的管和一個固定棒之間。樣品在管中不斷旋轉,光束照射通過樣品,從水平偏振光計算得平行吸收,從垂直偏振光計算得垂直吸收。庫埃特流UV LD是現在唯一商業上適用的平均LD取向方法
拉伸薄膜
拉伸薄膜線二色性譜是基於合併樣品分子和聚乙烯薄膜[3]的取向方法。拉伸聚乙烯薄膜導致原本隨機取向的分子'跟隨'薄膜的運動。薄膜的拉伸導致樣品分子和拉伸方向取向一致。
相關技術
參考書目
- ^ Alison Rodger and Bengt Nordén, Circular Dichroism and Linear Dichroism (1997) Oxford University Press, Oxford, UK. ISBN 019855897X.
- ^ Hannon, M.J., Moreno, V., Prieto, M.J., Molderheim, E., Sletten, E., Meistermann, I., Isaac, C.J., Sanders, K.J., Rodger, A. 「Intramolecular DNA coiling mediated by a metallo supramolecular cylinder」 Angewandte Chemie, 2001, 40, 879−884
- ^ Heinz Falk, Gunther Vormayr, Leon Margulies, Stephanie Metz and Yehuda Mazur 『A Linear Dichroism Study of Pyrromethene-, Pyrromethenone- and Bilatriene-abc-Derivates』 1986, Monatshefte fur Chemie, 117 : 849-858.