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奈米孔定序

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左圖是一張由幾個溶血素及雙鏈DNA連接在一起所形成複合體的示意圖。右圖則是這個複合體嵌入、穿過到奈米等級孔洞的過程示意。一旦這個複合體插入到奈米孔洞中後,溶血素就可在這個奈米系統中發揮作用
DNA通過奈米孔通道時如何產生電訊號的示意圖

奈米孔定序(英語:Nanopore sequencing),又稱納米孔測序,是一種針對核酸RNADNA)進行定序的第三代定序技術[1]

奈米孔定序技術不同於過去的基因定序技術,無須對樣品進行聚合酶鏈式反應或化學標記即可對一條DNA或RNA分子進行定序。奈米孔定序可以相對低廉的成本對個體進行基因型分型,並具可攜帶性高、樣品處理的過程簡易快速與可以即時分析結果等優點。目前奈米孔定序已被廣泛應用在各種領域,如病原體的快速檢測[2]、監測伊波拉病毒爆發的情況[3]、環境微生物監測[4]、食品安全監控、人類基因體定序[5]、植物基因體定序[6]抗生素抗藥性檢測[7]單倍型分析及其他相關應用。

核心原理

將一種納米級別的孔狀蛋白嵌入脂質雙分子層,置於一個微孔結構中,並在孔的兩側製造電壓,驅動 DNA 序列穿過奈米孔形成訊號。利用庫爾特原理,當 DNA 分子序列穿過奈米孔道時,不同 DNA 鹼基將產生不同的電阻,從而產生變化的電流。奈米孔定序儀根據偵測到的電流變化,就能夠識別出相應的鹼基種類,從而測定 DNA 分子的序列。[8]

單個奈米孔的定序速度由 DNA 序列穿過蛋白孔的速度決定,定序體系中配套了相應的來控制過孔速度。當在定序晶片上設置大量這樣的微型孔道,它們同時並行工作,就可以實現中、高通量的奈米孔定序。

該技術最早在 1996 年,由 John J. Kasianowicz、Eric Brandin、Daniel Branton、David W. Deamer 等人提出[9],並在 2015 年由 Oxford Nanopore Technologies 首次實現商用[10]

為將定序儀採集到的複雜電流訊號轉換為 DNA 序列,需要經過鹼基識別Basecalling)的過程。在奈米孔定序中,該過程通常藉助機器學習方法,使用預訓練的深度神經網絡完成。

技術特點

相較於其他定序技術,奈米孔定序:[11]

  • 儀器構造簡單,單次運行成本低,無需湊樣
  • 體積小,可便攜,擴展了定序使用場景
  • 可測得Mb級超長讀長,利於後續拼接、組裝以及註釋
  • 定序過程中無需進行合成,速度快
  • 可邊定序邊輸出結果進行同步分析,獲得有效結果後隨時中止定序

但受限於技術原理,奈米孔定序的準確率不能達到二代定序的水平,研究者通常會同時使用二代定序結果和奈米孔定序結果進行組裝,來獲取更準確全面的定序結果。

應用場景

微生物研究

微生物基因組組裝

奈米孔基因定序讀長長,更容易覆蓋複雜區域和結構變異區域,且獲得的長片段之間可以有更多的交叉重疊區域,更有利於組裝獲取正確的鹼基順序,得到短片段定序難以組裝的重複序列等的準確序列,便於組裝獲得更完整的微生物基因組或完整的質體,對其中的耐藥、毒力等相關功能元件進行精細化的構成分析。[12]

臨床研究

腫瘤研究

奈米孔基因定序可同時鑑定腫瘤相關的SNPInDel融合基因[13]、複雜重排等信息,還可以基於長片段序列鑑定基因表達差異和isoform信息,全面綜合地獲取患者的突變、腫瘤突變負荷或表達信息,更有利於患者的用藥與治療,提升患者生存率等。長讀長的特點在鑑定複雜長片段序列信息,比如結構變異、複雜重排、HLA分型等單體型分型場景,更具應用優勢。

感染性疾病研究

針對感染性樣本,基於宏基因組或靶向富集的核酸文庫的長片段定序,可獲得更長的病原基因組序列信息,有利於提升病原物種鑑定能力,並有效偵測耐藥基因和毒力基因等,進而準確診斷患者感染類型。[14]通過實時定序與數據分析,更有利於危重感染患者及時獲得偵測結果,便於及早進行治療介入,提升患者生存率和降低治療成本。

人類研究

SNP/InDel鑑定

單核苷酸多態性位點(SNP)和插入缺失位點(InDel)與眾多類型的腫瘤和遺傳病直接相關,也是祖源信息、特定表型信息等人類地理或表型特徵具有代表性的標誌物,SNP/InDel偵測廣泛應用於遺傳病和腫瘤研究、人群研究、法醫身份信息鑑定[15]等多場景。使用奈米孔定序鑑定人類基因組SNP/InDel,有望探索與挖掘更多SNP/InDel與疾病和表型關聯的可能性。

目標片段單體型分型

單體型是基因組上緊密連鎖的一段區域,一般不發生重組,傾向整體遺傳給後代。獲得個體目標區域單體型信息,有利於解析遺傳突變來源。傳統定序技術分析單體型一般是通過人群頻率計算或者短片段組裝的方法,具有複雜度高和準確性差的短板。使用奈米孔長片段定序技術,可以更輕鬆的獲得目標區域的單體型信息。

轉錄組研究

過去的十幾年裏,傳統RNA定序技術已經成了轉錄組研究不可或缺的工具,但傳統定序技術在鑑定全長轉錄本以及mRNA可變剪切產生的不同isoform時,由於片段較短的限制(特別是在不同基因具有相似序列信息時),難以獲得全面準確的信息。使用奈米孔長片段定序技術,可以更全面準確地獲得全長轉錄本與不同isoform的信息,與單細胞定序技術聯合應用也可獲得單細胞水平轉錄本特徵。[16]

結構變異鑑定

結構變異一般超過50bp,類型包括缺失、重複、倒位、易位與複雜重組等,其類型和大小極其多樣化。使用奈米孔長片段定序技術,能夠更全面準確地解析複雜區域信息,挖掘結構變異的價值。

技術進展

Oxford Nanopore Technologies 在2023年12月7日的新聞報道中,宣佈單分子定序的準確率中位數已達到 Q28 (99.8 %) 水平,且測得的單條 Q30 (99.9 %) read 最長達到1.1 M。[17]


參考文獻

  1. ^ Niedringhaus, Thomas P.; Milanova, Denitsa; Kerby, Matthew B.; Snyder, Michael P.; Barron, Annelise E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. Analytical Chemistry. 2011-06-15, 83 (12): 4327–4341. PMC 3437308可免費查閱. PMID 21612267. doi:10.1021/ac2010857. 
  2. ^ Greninger, Alexander L.; et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Medicine. 2015, 7 (1): 99. PMC 4587849可免費查閱. PMID 26416663. doi:10.1186/s13073-015-0220-9. 
  3. ^ Nick Loman. How a small backpack for fast genomic sequencing is helping combat Ebola. The Conversation. 15 May 2015 [2019-02-16]. (原始內容存檔於2020-10-29). 
  4. ^ TGAC's take on the first portable DNA sequencing 'laboratory'. EurekAlert!. 19 March 2015 [2019-02-16]. (原始內容存檔於2021-01-17). 
  5. ^ nanopore-wgs-consortium/NA12878. GitHub. [2017-01-10]. (原始內容存檔於2021-03-08). 
  6. ^ Solanum pennellii (new cultivar) - PlabiPD. www.plabipd.de. [2017-01-10]. (原始內容存檔於2020-01-28). 
  7. ^ Cao, Minh Duc; Ganesamoorthy, Devika; Elliott, Alysha G.; Zhang, Huihui; Cooper, Matthew A.; Coin, Lachlan J.M. Streaming algorithms for identification of pathogens and antibiotic resistance potential from real-time MinIONTM sequencing. GigaScience. 2016, 5 (1): 32. PMC 4960868可免費查閱. PMID 27457073. doi:10.1186/s13742-016-0137-2. 
  8. ^ 張得芳 馬秋月 尹佟明 夏濤. 第三代测序技术及其应用. 中國生物工程雜誌. 2013-05-25, 33 (5): 125–131 [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-15). 
  9. ^ Kasianowicz JJ; Brandin E; Branton D. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93: 13770–13773 [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-03-08). 
  10. ^ Continuous development and improvement. Oxford Nanopore Technologies. 2022-01-09 [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-16) (英語). 
  11. ^ 纳米孔链测序法. 齊碳科技. [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-16) (中文). 
  12. ^ 微生物研究. 齊碳科技. [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-16). 
  13. ^ marketing. 案例QI享|国产四代基因测序平台-融合基因快速检测数据展示. 微信公眾平台. [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-16). 
  14. ^ Jia X. A streamlined clinical metagenomic sequencing protocol for rapid pathogen identification. Sci Rep. 2021, 11. doi:10.1038/s41598-021-83812-x. 
  15. ^ Zheng Wang. Forensic nanopore sequencing of microhaplotype markers using QitanTech's QNome. Forensic Sci Int Genet. 2022 [2023-12-16]. doi:10.1016/j.fsigen.2021.102657. (原始內容存檔於2023-12-16). 
  16. ^ 人类研究. 齊碳科技. [2023-12-16]. (原始內容存檔於2023-12-16). 
  17. ^ Oxford Nanopore announces breakthrough performance in simplex single molecule accuracy to provide comprehensive genomic data for diverse customer types. Oxford Nanopore Technologies. [2023-12-15]. (原始內容存檔於2023-12-15) (英語).