定点突变
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定点突变(Site-directed mutagenesis),经由设计好的寡核苷酸,在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变,也就是说,这种突变是预先设定好的,所以也有人将它称为“反遗传法”。定点突变由加拿大生化学家迈克尔·史密斯发明,他与PCR发明者凯利·穆利斯在1993年共同获得诺贝尔化学奖。
根据生物学,基因会发生突变,突变可以自发也可以诱发。在定点突变法之前,突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法让基因突变,这属于随机突变。而突变株必须在生物体上有所改变,才能确定有突变发生。突变位置必须利用分生或化学方法来确定。而定点突变法可经由设计好的寡核苷酸,在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变,也就是说,这种突变是预先设定好的。
基本原理
定点突变的基本流程需要合成一个短的 DNA 引子。其包含了目标突变,并且与突变位点附近的模板 DNA 互补以与目的基因的 DNA 杂交。突变可以是一个碱基的改变(点突变),多个碱基的改变,增加或者删除。这个引物接着被一个 DNA 聚合酶延展,拷贝剩下的基因。拷贝后的基因包含了突变位点,并以载体的形式引入宿主细胞,并被复制。最后,突变将通过 DNA 测序以确保包含了目标突变。
原始的单引物延展法很低效,突变产量低。产物包含了原有的非突变模板以及突变链,突变及非突变后代混合在一起。此外,模板 DNA 经过甲基化,而突变链未经甲基化,由于偏爱甲基化模板 DNA 的错配修复系统的存在,导致突变数目进一步下降。因此,人们开发了许多新方法来提高突变效率。
方法
1.以有配对错误的单股DNA分子作为引物,此引物包含想要突变的核苷酸,与载体进行退火后,转化导入细胞内。 2.DNA双股使用DNA 聚合酶来延长,宿主会产生两种质体,进行克隆转译后即得到突变一个胺基酸的蛋白质。
应用
利用分子选殖的方法,可以改变基因上的特定碱基,送入载体之后,可在宿主中表现。亦可知道特定胺基酸的改变对蛋白质和酵素的影响。