定點突變
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定點突變(Site-directed mutagenesis),經由設計好的寡核苷酸,在任何一個基因片段上進行隨意或設計好的突變,也就是說,這種突變是預先設定好的,所以也有人將它稱為「反遺傳法」。定點突變由加拿大生化學家米高·史密斯發明,他與PCR發明者凱利·穆利斯在1993年共同獲得諾貝爾化學獎。
根據生物學,基因會發生突變,突變可以自發也可以誘發。在定點突變法之前,突變株的產生必須經由自然界或用化學等方法讓基因突變,這屬於隨機突變。而突變株必須在生物體上有所改變,才能確定有突變發生。突變位置必須利用分生或化學方法來確定。而定點突變法可經由設計好的寡核苷酸,在任何一個基因片段上進行隨意或設計好的突變,也就是說,這種突變是預先設定好的。
基本原理
定點突變的基本流程需要合成一個短的 DNA 引子。其包含了目標突變,並且與突變位點附近的模板 DNA 互補以與目的基因的 DNA 雜交。突變可以是一個鹼基的改變(點突變),多個鹼基的改變,增加或者刪除。這個引物接着被一個 DNA 聚合酶延展,拷貝剩下的基因。拷貝後的基因包含了突變位點,並以載體的形式引入宿主細胞,並被複製。最後,突變將通過 DNA 測序以確保包含了目標突變。
原始的單引物延展法很低效,突變產量低。產物包含了原有的非突變模板以及突變鏈,突變及非突變後代混合在一起。此外,模板 DNA 經過甲基化,而突變鏈未經甲基化,由於偏愛甲基化模板 DNA 的錯配修復系統的存在,導致突變數目進一步下降。因此,人們開發了許多新方法來提高突變效率。
方法
1.以有配對錯誤的單股DNA分子作為引物,此引物包含想要突變的核苷酸,與載體進行退火後,轉化導入細胞內。 2.DNA雙股使用DNA 聚合酶來延長,宿主會產生兩種質體,進行克隆轉譯後即得到突變一個胺基酸的蛋白質。
應用
利用分子選殖的方法,可以改變基因上的特定鹼基,送入載體之後,可在宿主中表現。亦可知道特定胺基酸的改變對蛋白質和酵素的影響。