螢光光譜是指某些物質經某波長入射光照射後,分子從能級Sa被激發至能級Sb,並在很短時間內去激發從Sb返回Sa,發出波長長於入射光的螢光。
螢光光譜原理
設分子能級為基態Sa,激發態Sb。
分子在能級Sa和Sb上的分佈按照波爾茲曼分佈規律:
![{\displaystyle n_{b}/n_{a}=e^{-(E_{b}-E_{a})}=e^{-h\nu /kT}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/60212b49fe8b1fa9977a6ba183633c4cded31ac2)
基態上分子數目變化速率為
![{\displaystyle -{\frac {dn_{a}}{dt}}=I(\nu )n_{a}B_{ab}-I(\nu )n_{b}B_{ba}-n_{b}A_{ba}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e3f9902c03126c38bf104f02433fc5055289ccb1)
平衡時(穩定態),上式為0:
又有:
遷移幾率(愛因斯坦係數)
![{\displaystyle B_{ab}=B_{ba}={\frac {2\pi }{3\hbar ^{2}}}D_{ab}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/4640d2da758dbe05015298350fc0acf2d008b93f)
偶極強度
![{\displaystyle D_{ab}=\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/dd4261822a9078be6d8ed783a507f4f6d72d8ea5)
頻率ν處的入射光強
![{\displaystyle I(\nu )={\frac {8{\pi }h{\nu ^{3}}}{c^{3}(e^{h{\nu }/kT}-1)}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/0dff6b7fc61ff8d7467f44087bdad161429b67bf)
推導出:
Sb通過發射光子從回到Sa的幾率,即衰減常數λ
![{\displaystyle A_{ba}=({\frac {32{\pi ^{3}}{\nu ^{3}}}{3c^{3}\hbar }})\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e0ccc4d0743bc6f08339307625dd27645c0bd296)
Sb上的分子去激發速率
![{\displaystyle {\frac {dn_{b}}{dt}}=-A_{ba}n_{b}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/5c2fa2ad1f27fba5818b328961a0b2f352521b46)
上式的一個解為
![{\displaystyle n_{b}(t)=n_{b}(0)e^{-A_{ba}t}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/cf037195c93ebc0d6635debe1bb295ae6b97d4ff)
可見激發態上的分子數目以指數形式衰減,衰減常數為Aba
Sb的輻射壽命為(此處參考指數衰減)
![{\displaystyle \tau _{R}={\frac {1}{A_{ba}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/fc04c07aa13e01e5b657364aecae57679302143e)
此僅當吸收的光子和隨後發射的光子相同時候有效,即全部吸收的光能量通過輻射過程全部發出光子消耗掉。
而實測時激發態壽命很少和上述壽命一致,因為激發態除了直接發射光子外有很多其他途徑失去能量。
Sb通過發出螢光回到Sa的過程的反應速率,即固有螢光速率常數 kF
![{\displaystyle k_{F}=A_{ba}={\frac {1}{\tau _{R}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/f36ca0acd273b7dbf66b4e248ac8985a7d3c44cb)
Sb回到Sa的其他非輻射途徑包括內轉變,系統間轉變,猝熄作用,其速率常數分別為kIC,kIS,kQ[Q]
則Sb總的去激化(熄滅)常數為kF+kIC+kIS+kQ[Q]
螢光量子產率
![{\displaystyle \phi _{F}={\frac {k_{F}}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/c8279eda716bf8df8779f098daf8a44675453c7b)
也可以寫作發射光子數/吸收光子數,即發射的螢光光子數/入射光照射時的吸收量
因為大量的非輻射過程的存在,所以激發態實際衰減時間遠小於理想的輻射壽命τR
描述此動力學過程
![{\displaystyle -{\frac {d[S_{b}]}{dt}}=(k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q])[S_{b}]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/88079b6ee87943a607072815fd16dda15373899a)
此方程的一個解為
![{\displaystyle S_{b}(t)=S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/c8835620bf3d3f12b086a6dc651cd4cebdf28eac)
Sb是激發態上的分子數
斯托克斯位移
吸收曲線的0,0躍遷與發射曲線的0,0躍遷不重合,之間有一位移,螢光光譜較相應的吸收光譜紅移。
原因是分子在處於激發態期間進行了重定向/重排布,消耗了能量,故螢光光譜的0,0峰向低能量(高波長)方向平移。
螢光強度
![{\displaystyle A=\epsilon cl=lg{\frac {I_{0}}{I}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/dc5418ffaf49bf8d54aea5d3de70468bff9b9684)
得到
![{\displaystyle I=I_{0}e^{-2.303\epsilon cl}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/caf9759b70511bbb7d83b0b945c154debe32667b)
觀測發射強度為
![{\displaystyle F(\lambda )=2.303\epsilon clI_{0}\phi _{F}f(\lambda )d=\epsilon \phi _{F}f(\lambda )cI_{0}k}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/79725a3445ff2d8b7811c8a3d931fb61c3ae73f4)
k=2.303ld
給一束脈衝入射光後,發射光在脈衝後的時間t時的強度I(t),與激發態的衰減率dSb/dt及激發態通過螢光衰減的比率φF(量子產率)成比例:
![{\displaystyle I(t)={\frac {dS_{b}}{dt}}\phi _{F}=S_{b}(0)({\frac {\phi _{F}}{\tau _{F}}}e^{-t/\tau _{F}}=k_{F}S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/186822d7c074ad2d820162469572c3b3e349e8b7)
隨時間表現為指數衰減
系統內有一種螢光物質時:
![{\displaystyle E_{m}(t)=Ae^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/124e1822c509b39542a18ab3de733b265746a43d)
系統中有兩種螢光物質時:
![{\displaystyle E_{m}(t)=A_{1}e^{-t/\tau _{1F}}+A_{2}e^{-t/\tau _{2F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a9ece19a32263ae1528c053f6ec30ac1d919c68a)
Em是螢光強度,上述公式為螢光衰減(decay)公式
內部濾光效應
對高濃度溶液而言,螢光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系統前半部分被吸收,發射的螢光被再吸收,只有少量的螢光通過狹縫入射到螢光探測器上,使得探測到的螢光強度減少。
外環境影響
去激發同樣可能由於碰撞或和溶劑分子的混合導致,以速率kQ[Q]發生。和其他過程不同,考慮碰撞時此猝熄是一個雙分子過程。
Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])
因為Q通常濃度遠大於Sb ,此過程被視為一個偽一級反應,kQ[Q]的值可通過變化猝熄劑Q的濃度,觀察對φF的影響測得。芳香類發色基的輻射壽命通常為1*10-9到100*10-9秒。因此,相比較而言,猝熄過程是相當有效率的。普遍的猝熄劑如O2和I-離子,每和激發態分子碰撞一次就會使其去激發一次。此反應速率僅被擴散限制。在微摩爾濃度猝熄劑下,碰撞發生速率為108每秒,因此可以觀察到明顯的猝熄。
![{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S}}=1+k_{Q}[Q]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d31d14808b92ddadf6861c85e06680379fcab731)
τ0可測,以F0/F對[Q]作圖求得kQ
螢光共振能量遷移
簡稱FRET,此過程適用與計算兩端帶發色基的高分子長度。
存在供體D和受體A,當光入射時,激發基態供體Da→Db,Db又去激發,通過共振將能量傳遞給Aa,使得Aa→Ab。
定義遷移效率(E)是Db去激發傳遞能量到Aa佔總Db去激發的比例
![{\displaystyle E={\frac {k_{T}}{k_{T}+k_{F}^{D}<+k_{I}C^{D}<+k_{I}S^{D}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e3e1c1f55afa6ddcb62e39c557ecf4c9884715d6)
通過一系列複雜的計算和變化,此處省略,得:
![{\displaystyle k_{T}={\frac {1}{\tau _{0}}}{\frac {R_{0}}{R}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d115f0b1cbc391f6f5c8aee52e1a46fa84e65ee3)
![{\displaystyle R_{0}=9.7*10^{3}(J\kappa ^{2}n^{-4}\phi _{D})^{\frac {1}{6}}cm}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/4be73d12120eb2e3d17c88c5c43379624da3210f)
![{\displaystyle J=\int \epsilon (\nu )f_{D}(\nu )\nu ^{-4}\,d\nu }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/09fc81aa5c53ca37f3fe01e23396e957f506d1da)
推導出:
![{\displaystyle E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+R^{6}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/eae52fd513bb207ed2f67144766136fac9e4de66)
這裏R0對一個固定的化學系統而言是常數,R是供體和受體之間的距離,R越接近R0,測計算越精確。
此外計算E的方法有:
![{\displaystyle {\frac {\phi _{D+A}}{\phi _{D}}}=1-E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/83b529d16ae7a276851a621f0e15cb3555ea034a)
![{\displaystyle {\frac {F_{D+A}}{F_{A}}}=1+{\frac {\epsilon _{D}c_{D}}{\epsilon _{A}c_{A}}}E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/838e8667b0eebf735120266a312fb9aec3ffcc28)
![{\displaystyle {\frac {\tau _{D,A}}{\tau _{D}}}=1-E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a6385ff46ea76f1fcfd6cd6f9ec36efa03bd0276)
參考文獻
- C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.