螢光光譜

螢光光譜是指某些物質經某波長入射光照射後，分子從能級S_a被激發至能級S_b，並在很短時間內去激發從S_b返回S_a，發出波長長於入射光的螢光。

螢光光譜原理

設分子能級為基態S_a，激發態S_b。

分子在能級S_a和S_b上的分布按照波爾茲曼分布規律：

$n_{b}/n_{a}=e^{-(E_{b}-E_{a})}=e^{-h\nu /kT}$

基態上分子數目變化速率為

$-{\frac {dn_{a}}{dt}}=I(\nu )n_{a}B_{ab}-I(\nu )n_{b}B_{ba}-n_{b}A_{ba}$

平衡時（穩定態），上式為0： 又有：

遷移機率（愛因斯坦係數）

$B_{ab}=B_{ba}={\frac {2\pi }{3\hbar ^{2}}}D_{ab}$

偶極強度

$D_{ab}=\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid$

頻率ν處的入射光強

$I(\nu )={\frac {8{\pi }h{\nu ^{3}}}{c^{3}(e^{h{\nu }/kT}-1)}}$

推導出： S_b通過發射光子從回到S_a的機率，即衰減常數λ

$A_{ba}=({\frac {32{\pi ^{3}}{\nu ^{3}}}{3c^{3}\hbar }})\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid$

S_b上的分子去激發速率

${\frac {dn_{b}}{dt}}=-A_{ba}n_{b}$

上式的一個解為

$n_{b}(t)=n_{b}(0)e^{-A_{ba}t}$

可見激發態上的分子數目以指數形式衰減，衰減常數為A_ba S_b的輻射壽命為（此處參考指數衰減）

$\tau _{R}={\frac {1}{A_{ba}}}$

此僅當吸收的光子和隨後發射的光子相同時候有效，即全部吸收的光能量通過輻射過程全部發出光子消耗掉。 而實測時激發態壽命很少和上述壽命一致，因為激發態除了直接發射光子外有很多其他途徑失去能量。

S_b通過發出螢光回到S_a的過程的反應速率，即固有螢光速率常數 k_F

$k_{F}=A_{ba}={\frac {1}{\tau _{R}}}$

S_b回到S_a的其他非輻射途徑包括內轉變，系統間轉變，猝熄作用，其速率常數分別為k_IC,k_IS,k_Q[Q] 則S_b總的去激化（熄滅）常數為k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]

螢光量子產率

$\phi _{F}={\frac {k_{F}}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}}$

也可以寫作發射光子數/吸收光子數，即發射的螢光光子數/入射光照射時的吸收量

因為大量的非輻射過程的存在，所以激發態實際衰減時間遠小於理想的輻射壽命τ_R 描述此動力學過程

$-{\frac {d[S_{b}]}{dt}}=(k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q])[S_{b}]$

此方程的一個解為

$S_{b}(t)=S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}$

S_b是激發態上的分子數

斯托克斯位移

主條目：斯托克斯位移

吸收曲線的0,0躍遷與發射曲線的0,0躍遷不重合，之間有一位移，螢光光譜較相應的吸收光譜紅移。 原因是分子在處於激發態期間進行了重定向/重排布，消耗了能量，故螢光光譜的0,0峰向低能量（高波長）方向平移。

螢光強度

$A=\epsilon cl=lg{\frac {I_{0}}{I}}$

得到

$I=I_{0}e^{-2.303\epsilon cl}$

觀測發射強度為

$F(\lambda )=2.303\epsilon clI_{0}\phi _{F}f(\lambda )d=\epsilon \phi _{F}f(\lambda )cI_{0}k$

k=2.303ld

給一束脈衝入射光後，發射光在脈衝後的時間t時的強度I(t)，與激發態的衰減率dS_b/dt及激發態通過螢光衰減的比率φ_F（量子產率）成比例：

$I(t)={\frac {dS_{b}}{dt}}\phi _{F}=S_{b}(0)({\frac {\phi _{F}}{\tau _{F}}}e^{-t/\tau _{F}}=k_{F}S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}$

隨時間表現為指數衰減

系統內有一種螢光物質時：

$E_{m}(t)=Ae^{-t/\tau _{F}}$

系統中有兩種螢光物質時：

$E_{m}(t)=A_{1}e^{-t/\tau _{1F}}+A_{2}e^{-t/\tau _{2F}}$

Em是螢光強度，上述公式為螢光衰減（decay）公式

內部濾光效應

對高濃度溶液而言，螢光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系統前半部分被吸收，發射的螢光被再吸收，只有少量的螢光通過狹縫入射到螢光探測器上，使得探測到的螢光強度減少。

外環境影響

去激發同樣可能由於碰撞或和溶劑分子的混合導致，以速率k_Q[Q]發生。和其他過程不同，考慮碰撞時此猝熄是一個雙分子過程。 S_b + Q → S_a + Q (k_Q[Q])

因為Q通常濃度遠大於S_b ，此過程被視為一個偽一級反應，k_Q[Q]的值可通過變化猝熄劑Q的濃度，觀察對φ_F的影響測得。芳香類發色基的輻射壽命通常為1*10^-9到100*10^-9秒。因此，相比較而言，猝熄過程是相當有效率的。普遍的猝熄劑如O₂和I^-離子，每和激發態分子碰撞一次就會使其去激發一次。此反應速率僅被擴散限制。在微摩爾濃度猝熄劑下，碰撞發生速率為10⁸每秒，因此可以觀察到明顯的猝熄。

${\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S}}=1+k_{Q}[Q]$

τ₀可測，以F₀/F對[Q]作圖求得k_Q

螢光共振能量遷移

簡稱FRET，此過程適用與計算兩端帶發色基的高分子長度。

存在供體D和受體A，當光入射時，激發基態供體Da→Db，Db又去激發，通過共振將能量傳遞給Aa，使得Aa→Ab。

定義遷移效率（E）是Db去激發傳遞能量到Aa占總Db去激發的比例

$E={\frac {k_{T}}{k_{T}+k_{F}^{D}<+k_{I}C^{D}<+k_{I}S^{D}}}$

通過一系列複雜的計算和變化，此處省略，得：

$k_{T}={\frac {1}{\tau _{0}}}{\frac {R_{0}}{R}}$

$R_{0}=9.7*10^{3}(J\kappa ^{2}n^{-4}\phi _{D})^{\frac {1}{6}}cm$

$J=\int \epsilon (\nu )f_{D}(\nu )\nu ^{-4}\,d\nu$

推導出：

$E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+R^{6}}}$

這裡R₀對一個固定的化學系統而言是常數，R是供體和受體之間的距離，R越接近R₀，測計算越精確。

此外計算E的方法有：

${\frac {\phi _{D+A}}{\phi _{D}}}=1-E$

${\frac {F_{D+A}}{F_{A}}}=1+{\frac {\epsilon _{D}c_{D}}{\epsilon _{A}c_{A}}}E$

${\frac {\tau _{D,A}}{\tau _{D}}}=1-E$

參考文獻

• C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.